#植物单细胞核转录组利用单细胞核转录组挑战非模式生物-荔枝花芽发育分化过程

近期，发表于《Journal of Experimental Botany》的植物单细胞核转录组文献，以荔枝成花过程中关键发育时期的三种不同状态的芽为研究对象，首次建立荔枝芽样本的单细胞核测序体系，完成了首例荔枝单细胞图谱构建。

从单细胞水平解析了荔枝芽成花转变的分子调控网络，充分说明植物抽核提升了研究水平！从样品制备上来讲，除原生质体难制备之外，scRNA-seq的样品要求较高，除了对数目有要求外，对细胞活性也有相关的规定，在临床上的大量冰冻样本都无法进行这种技术检测，而snRNA-seq就很好地解决了这个问题。

一、研究背景

荔枝是一种高度蜡状的木本植物，在技术上很难分离出纯原生质体。从营养生长到生殖生长的转变，称为花的转变，是被子植物生命周期中的一个关键事件，与重要经济作物的年产量密切相关。然而，对静止芽、芽从营养生长过渡到生殖生长以及断裂芽的复杂调控网络的全面了解还远未实现。

二、研究思路

采集了三种不同的芽类型进行snRNA-seq：未分化的芽（低温诱导1个月后的休眠芽：U）、营养芽（V）和由未分化的芽发育而来的花芽（F）。采用病毒诱导的基因沉默、RT-qPCR、RNA点杂交、原位杂交等方法，研究和验证了TFL1在荔枝开花中的作用。

图 分析流程

三、主要结果

1、荔枝芽样snRNA-seq主要结果

利用芽的三种不同形态组织（U、V、F）（图1A）进行单细胞核测序，总共分析了表达 21 402 个基因的 41 641 个细胞核（图2），揭示了对应12 个群体的 35 个细胞簇（图3A）。在35个细胞簇中根据不同分子特征表达标记基因对簇进行定义和注释（图3B)。叶肉细胞（MC）群体由7个簇组成（簇A1、A3、A10、A21、A24、A27和A34）组成，其中参与光合作用的基因，如双孢杆菌羧化酶小亚基1（RBCS1）、脂氧合酶2.1（LOX2.1）和LOX6是主要表达的基因。一组未知的细胞特异性存在于U芽中，而被定义为叶肉细胞的细胞仅在F中发现（图3D）。

图1 荔枝芽样品的图像及分离芽核的质量控制

图2 荔枝芽胚根细胞图谱的生成

图3 不同荔枝芽类型细胞的异质性分析

2、在单细胞分辨率下的不同细胞群的比较

为了鉴定与芽休眠和花过渡相关的关键基因，将仅在花芽中发现的基因表达(“F_only”）与其余细胞（“F_only-”）的基因表达进行比较（图4A），参与光合作用的基因（RBCS1、LITCHI008481）、表皮细胞分化、脂肪酸代谢和细胞发育叶片（FDH，LITCHI017426）和叶片的发育量（PDF1，LITCHI026999）基因均未表达（图4B，C）。其中基因LITCHI014472在“U_only”细胞中特异性表达（图4F），该基因可能是进一步研究花的发育和花的过渡的关键基因。

图 4 t-SNE可视化显示了特定的细胞群及其细胞数量

花的转变依赖于一个复杂的调控网络。为了确定567个FMC背后的调控网络，作者接下来分析了一组开花相关基因之间的表达相关性（图5）。在FMC群体中，作者鉴定了一个之前推测的HOS1（LITCHI022757）基因，发现了一个未知的调控基因GAI（LITCHI008177），其中GAI和AP2与该网络的其他成分主要呈负相关。

图5 567个花芽分生组织细胞在单细胞分辨率中开花相关基因表达的相关性

3、细胞分化轨迹

使用了943个高度表达基因来可视化来自U、V和F群体的细胞之间可能的拓扑结构，来揭示三种芽类型的细胞的层次结构（图6)。细胞被分为四个不同的亚群（d1-d4）。U芽细胞主要聚集在d1和d2的末端，d4与V芽相关。在连接四个亚群的中心区域，所有三种芽类型的细胞都存在。与营养生长或花生长相关的基因（图6C），如AP1、AGL8、AP2、FLC和PCKA在三个不同的簇中被发现，每个簇都处于不同的活性区域发育过程。拟时间热图很好地反映了开花或营养的轨迹过程。

图6 芽的分化轨迹

4、LcTFL1-2在FT和TFL1的花转化和mRNA运输中的作用

LcFT1（LITCHI002331)和LcTFL1-2（LITCHI024460）是荔枝叶片中主要表达的FT/TFL成员。本研究选取4个开花时间不同的品种进行了研究LcFT1和LcTFL1-2在花过渡过程中的表达。虽然4个品种间的相对表达水平存在显著差异，但LcFT1的转录水平均有所增加（图7A)。为了证实LcTFL1-2在荔枝花转化中的作用，使用VIGS沉默该基因，与含有pTRV2空载体的阴性对照植株相比，LcTFL1-2在沉默的芽和叶片样品中的表达均显著降低（图7B）。观察到LcTFL1-2下调后，开花速率显著增加，表明LcTFL1-2作为花的抑制剂（图7C）。

为了证实荔枝芽中FT和TFL1 mRNA的存在，采用了mRNA的原位杂交和RNA点杂交试验。花芽的LcFT1 mRNA水平高于营养芽（图8A）。为了证实检测到的芽LcFT1和LcTFL1-2不是原位转录的结果，检测了花芽、营养芽、叶片和茎样本中提取的总RNA、mRNA和核RNA的表达量。LcFT1和LcTFL1-2 mRNA在所有总RNA和mRNA样本中均有检测到，但只在来自叶片样本的找到了核RNA（图8B）。

图7 LcFT1和LcTFL1-2的表达分析

图8 LcFT1和LcTFL1-2在荔枝芽、叶和茎样品中的表达

四、研究结论

单细胞核测序使人们能够更全面地了解荔枝花芽转变过程中的分子事件，以及识别新的调节因子。单细胞核转录组测序（snRNA-seq）是对单个的细胞核进行整体测序，和单细胞测序相比，适用对象更广（除新鲜样本外，冰冻样本也可使用）；细胞悬液制备简单，减少酶解、机械压力诱导的假细胞类群产生；在数据分析方面，可以获得内含子区、基因间区的数据，使细胞类型的鉴定分辨率更高，信息更加丰富。

参考文献

Yang, M.C，et al. Single-nucleus RNA sequencing and mRNA hybridization indicate key bud events and LcFT1 and LcTFL1-2 mRNA transportability during floral transition in litchi. Journal of experimental botany，2023.